First Colombian consensus on congenital Chagas and clinical approach for women of child-bearing age diagnosed with Chagas / Primer consenso colombiano sobre Chagas congénito y orientación clínica a mujeres en edad fértil con diagnóstico de Chagas

Congenital transmission of Chagas disease has not been extensively studied in Colombia, and there are no standardized processes in the health system regarding the specific diagnosis, treatment and follow-up of this disease. To generate recommendations on congenital Chagas disease and Chagas in women of childbearing age in Colombia, a consensus of experts was developed. An extensive literature search through the Medline database was carried out using the MeSH terms: «Chagas disease/congenital¼, «prevention and control¼, «diagnosis¼, «therapeutics¼ and «pregnancy¼. Appropriate abstracts were selected and the full texts were analyzed. The relevant information was synthesized, classified, and organized into tables and figures and was presented to a panel of experts, which was composed of 30 professionals from various fields. Based on the Delphi methodology, three rounds of consultation were conducted. The first and second rounds were based on electronic questionnaires that measured the level of consensus of each question among the participants. The third round was based on a face-to-face discussion focusing on those questions without consensus in the previous consultations. The evidence was adapted to national circumstances on a case-by-case basis, and the content the final document was approved. These recommendations are proposed for use in routine medical practice by health professionals in Colombia.

La transmisión congénita de la enfermedad de Chagas ha sido poco estudiada en Colombia y existen pocos procedimientos rutinarios en el sistema de salud para el manejo de esta enfermedad. Por ello se desarrolló un consenso de expertos dirigido a generar recomendaciones de diagnóstico y tratamiento de Chagas con- génito y orientación a mujeres en edad fértil. Con ese propósito se realizó una búsqueda extensiva de la literatura, empleando una combinación de términos Mes (Chagas, Chagas congénito, prevención, control, diagnóstico, tratamiento y embarazo) para reflejar el estado del arte en cada tema de interés. Después de ello, se leyeron los resúmenes y aquellos seleccionados para análisis del texto completo. La literatura relevante se sintetizo, clasifico y organizo en tablas y se presentó al panel de expertos, el cual estaba constituido por 30 profesionales en diferentes áreas. Mediante la metodología Delphi se realizaron 2 rondas de cuestionarios virtuales y una reunión presencial en los cuales se evaluaron los niveles de acuerdo entre los participantes. Los puntos con falta de consenso durante las 2 rondas virtuales se expusieron durante las mesas de discusión en la ronda presencial. La evidencia utilizada se adaptó a las particularidades nacionales según el caso y se aprobó el contenido del documento final. Se propone que estas recomendaciones sean usadas por profesionales de la salud en Colombia.

Evaluación preliminar de la prueba comercial Chagas ( Trypanosoma cruzi ) IgG-ELISA ® en individuos colombianos / Preliminary evaluation of the commercial kit Chagas ( Trypanosoma cruzi ) IgG-ELISA ® in Colombian individuals

Introducción. El diagnóstico de la enfermedad de Chagas es fundamental para brindar un tratamiento oportuno y mejorar el pronóstico del paciente. La capacidad discriminatoria de las pruebas serológicas para el diagnóstico varía de acuerdo con la prevalencia de la enfermedad y el antígeno utilizado en la prueba. Objetivo. Evaluar la capacidad discriminatoria de la prueba comercial Chagas ( Trypanosoma cruzi ) IgG-ELISA ® (NovaTec Immunodiagnostica GmbH) en un grupo de individuos colombianos utilizando la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) como referencia. Materiales y métodos. Se incluyeron 78 muestras de pacientes crónicos (36 asintomáticos y 42 sintomáticos) y 21 de controles sanos. También se analizaron 17 individuos no infectados con riesgo epidemiológico para la enfermedad de Chagas, siete con leishmaniasis y nueve con enfermedad cardiaca. Se evaluaron por PCR en tiempo real cuatro individuos cuyos resultados variaron entre pruebas. Resultados. Se encontraron diferencias significativas a una densidad óptica de 450 nm (p<0,0001) al comparar la mediana de la absorbancia entre los controles sanos (0,143) y los asintomáticos (2,401) o sintomáticos (2,776), entre los asintomáticos y sintomáticos (p=0,0408), entre los seronegativos con riesgo (0,232), individuos con enfermedades cardiacas (0,367) o con leishmaniasis (0,337) y los pacientes con enfermedad de Chagas (p<0,0001), y entre los controles sanos y los pacientes seronegativos con riesgo (p=0,0264), con enfermedades cardiacas (p=0,0015) o con leishmaniasis (p=0,002). La PCR en tiempo real fue positiva en tres de los cuatro casos. Conclusiones. Esta prueba comercial de ELISA permitió discriminar a los pacientes con Chagas de los controles. Se requieren estudios de fase II para determinar las características operativas de la prueba.

Introduction: The diagnosis of Chagas´ disease is essential to provide early treatment and improve patients´ prognosis . The discriminatory efficiency of the serological tests varies according to the disease prevalence and the test- antigen used . Objective: To evaluate the discriminatory efficiency of the commercial kit Chagas ( Trypanosoma cruzi ) IgG-ELISA ® (Nova Tec Immunodiagnostica GmbBH) in a group of Colombian individuals, using indirect immunofluorescence antibody testing (IFAT) and enzyme immunoassay (ELISA) tests as references. Materials and methods: Seventy-eight samples from chronic chagasic patients (36 asymptomatic and 42 symptomatic) and 21 healthy controls were included. Seventeen samples from non-infected people with Chagas´ disease epidemiological risk, seven with leishmaniasis and nine with non-chagasic cardiomyopathy were also analyzed. Real time PCR was performed on four individuals whose results differed among tests. Results: Significant differences at 450 nm optical absorbance were found (p<0.0001) when the median absorbance values of healthy controls (0.143), asymptomatic (2.401) and symptomatic (2.776) chagasic patients were compared, as well as when asymptomatic and symptomatic patients (p=0.0408) and seronegative people with epidemiological risk (0.232), cardiomyopathy (0.367) or leishmaniasis (0.337) were compared with chagasic patients (p<0.0001). Finally, there were differences among healthy controls and non-infected people with epidemiological risk (p=0.0264), patients with non-chagasic cardiomyopathy (p=0.0015) and patients with leishmaniasis (p=0.002). Real-time PCR was positive in three out of four analyzed cases. Conclusions: The commercial ELISA test allowed us to discriminate the chagasic patients from the controls. A phase II study of diagnostic tests for determining field reliability of this test is required.

Primer consenso colombiano sobre Chagas congénito y orientación clínica a mujeres en edad fértil con diagnóstico de Chagas / First Colombian consensus on congenital Chagas and clinical approach to women of fertile age diagnosed with Chagas

La transmisión congénita de la enfermedad de Chagas ha sido poco estudiada en Colombia y existen pocos procedimientos rutinarios en el sistema de salud para el manejo de esta enfermedad. Por ello se desarrolló un consenso de expertos dirigido a generar recomendaciones de diagnóstico y tratamiento de Chagas congénito y orientación a mujeres en edad fértil. Con ese propósito se realizó una búsqueda extensiva de la literatura, empleando una combinación de términos MeSH (Chagas, Chagas congénito, prevención, control, diagnóstico, tratamiento y embarazo) para reflejar el estado del arte en cada tema de interés. Después de ello, se leyeron los resúmenes y aquellos seleccionados para análisis del texto completo. La literatura relevante se sintetizó, clasificó y organizó en tablas y se presentó al panel de expertos, el cual estaba constituido por 30 profesionales en diferentes áreas. Mediante la metodología Delphi se realizaron 2 rondas de cuestionarios virtuales y una reunión presencial en los cuales se evaluaron los niveles de acuerdo entre los participantes. Los puntos con falta de consenso durante las 2 rondas virtuales se expusieron durante las mesas de discusión en la ronda presencial. La evidencia utilizada se adaptó a las particularidades nacionales según el caso y se aprobó el contenido del documento final. Se propone que estas recomendaciones sean usadas por profesionales de la salud en Colombia.

Congenital transmission of Chagas disease has not been extensively studied in Colombia, and there are no standardized processes in the health system regarding the specific diagnosis, treatment and follow-up of this disease. In order to generate recommendations on congenital Chagas disease and Chagas in women of childbearing age in Colombia, a consensus of experts was developed. An extensive literature search through the Medline database was carried out using the MeSH terms: " Chagas disease/congenital " , " prevention and control " , " diagnosis " , " therapeutics " and " pregnancy " . Appropriate abstracts were selected and the full texts were analyzed. The relevant information was synthesized, classified, and organized into tables and figures and was presented to a panel of experts, which was composed of 30 professionals from various fields. Based on the Delphi methodology, three rounds of consultation were conducted. The first and second rounds were based on electronic questionnaires that measured the level of consensus of each question among the participants. The third round was based on a face-toface discussion focusing on those questions without consensus in the previous consultations. The evidence was adapted to national circumstances on a case-by-case basis, and the content the final document was approved. These recommendations are proposed for use in routine medical practice by health professionals in Colombia.

Seguimiento de pacientes con enfermedad de chagas y trasplante de corazón mediante las PCR S35-S36 y TcH2AF-R / Using S35-S36 and TcH2AF-R primer-based PCR tests to follow-up a Chagas’ disease patient who had undergone a heart transplant

Introducción. La cardiomiopatía es la forma clínica más común de la enfermedad de Chagas en Colombia, siendo el trasplante una opción para su tratamiento. Debido al riesgo de reactivación de la infección posterior al trasplante, es prioritario vigilar el comportamiento del parásito. Objetivo. Presentar el caso de un paciente con cardiopatía chagásica dilatada y falla cardiaca, a quien se le practicó trasplante de corazón y se le hizo seguimiento mediante PCR, análisis histopatológicos y ecocardiográficos. Materiales y métodos. Se tomaron muestras de sangre antes de la intervención y después de ella y de biopsias endomiocárdicas posteriores al trasplante. El ADN extraído fue amplificado con los iniciadores TcH2AF-R y S35-S36. La parasitemia se examinó mediante la técnica de microhematocrito. Se practicaron estudios histopatológicos para determinar la presencia del parásito o el rechazo del trasplante y, ecocardiográficos, para evaluar la función cardiaca. Resultados. De las muestras de sangre tomadas a los 83 y 48 días previos al trasplante, la última fue positiva por la PCR S35-S36. Hasta el segundo mes después del trasplante, ambas PCR fueron negativas. Al tercer mes después del trasplante, ambas PCR fueron positivas, por lo cual se inició tratamiento con nifurtimox. Tras 35 días de haberse iniciado el tratamiento, ambas pruebas presentaron resultados negativos, al igual que las tomadas a los 0, 3, 10 y 12 meses posteriores. Los resultados de la histopatología, del microhematocrito y de las PCR de las biopsias, fueron negativos en todas las fechas. Conclusiones. Las PCR permitieron sospechar la reactivación de la infección en el paciente, se le administró el tratamiento y posterioremente las pruebas se tornaron negativas. La evolución clínica del paciente ha sido favorable.

Introduction. Cardiomyopathy is the most common clinical form of Chagas’ disease in Colombia, and one treatment option is a heart transplant. Tracking the behavior of the Chagas’ parasite, Trypanosoma cruzi, is a priority due to the risk of post-transplant reactivation of the infection. Objective. A case is presented of a patient who had suffered from dilated chagasic cardiopathy and cardiac failure, and had subsequently undergone heart transplant. The case was monitored by PCR, histopathological and echocardiographic examinations. Materials and methods. Blood samples were drawn before and after the transplant, and post-transplant endomyocardial biopsies were taken. The extracted DNA was amplified with the TcH2AF-R and S35-S36 primers. Parasitemia was examined by the microhematocrit test. In addition, histopathological studies determined the parasite presence and transplant rejection status. Echocardiograms were administered to evaluate cardiac function. Results. Of the blood samples taken 83 and 48 days pre-transplant, the latter was positive by the S35-S36 PCR test. PCR tests in blood with both primers were negative up to the second month post-transplant. However, both PCR tests were positive by the third month post-transplant. Thereupon, the patient was treated with nifurtimox. Both tests presented negative results in blood 35 days after treatment was started and remained negative thereafter at 0, 3, 10 and 12 months post-treatment. The pathology, microhematocrit, and PCR test results from biopsies were negative on all the specified dates. Conclusions. PCR tests were used as indicators of a reactivation of trypanosomid infection in the patient. After treatment administration, PCR tests became negative. The patient’s clinical evolution was favorable.

Reporte del primer caso de enfermedad de Chagas transplacentaria analizado por AP-PCR en Moniquirá, Boyacá / The first case of congenital Chagas' disease analyzed by AP-PCR in Colombia

Introducción. La principal vía de transmisión de la enfermedad de Chagas es por medio de los insectos vectores de la familia Reduviidae. Sin embargo, el parásito también puede ser transmitido de madres infectadas al feto in utero. Hasta la fecha no existen informes de casos de Chagas transplacentario en Colombia. Objetivo. Presentar un caso de transmisión transplacentaria ocurrido en Moniquirá, Boyacá, Colombia, y confirmarlo con el análisis de las cepas aisladas de la madre y de su bebé mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores arbitrarios. Materiales y métodos. De los hemocultivos positivos de una madre chagásica y su hijo, se extrajo el ADN de los tripanosomas y se caracterizá la especie y grupo por PCR. El genotipo de las cepas se determinó mediante AP-PCR con los iniciadores basados en los genes de b-globina (5’-CCTCACCTTCTTTCATGGAG-3’) y del ARNr 16S (5’-ACGGGCAGTGTGTACAAGACC-3’), en reacciones diferentes. Resultados. Las cepas de Trypanosoma cruzi aisladas de los hemocultivos de la madre y de su hijo mostraron el mismo perfil de amplificación por ambas pruebas de AP-PCR, concordante con el observado en las cepas T. cruzi I utilizadas como control. En los hemocultivos procedentes del reción nacido se encontrá también T. cruzi II. Conclusiones. Éste es el primer caso de enfermedad de Chagas transplacentaria reportado en el municipio de Moniquirá, que demuestra que esta forma de transmisión ocurre en el país. La presencia de infección mixta por ambos grupos de T. cruzi en las muestras del recién nacido, sugiere infección mixta en la madre, con mayor prevalencia de T. cruzi I, al menos en el hemocultivo.

Introduction. The main route of Chagas disease transmission is through vectors of the insect family Reduviidae. However, the parasite can also be transmitted from infected mothers to their fetus in utero. Until now, no cases of congenital Chagas disease have been reported in Colombia. Objective. A congenital Chagas disease case occurred in Moniquirá County, Boyacá, Colombia. It was confirmed by comparing strains isolated from the mother and her baby using polymerase chain reaction (PCR) with arbitrary primers. Materials and methods. The parasite DNA was extracted from positive blood cultures of the aflicted mother and her son. The species confirmation and group detection were performed by PCR. The strain genotypes were determined by AP-PCR with two oligonucleotides based on the genes for the b-globin (5’-CCTCACCTTCTTTCATGGAG-3’) and 16S RrNA (5’-ACGGGCAGTGTGTACAAGACC-3’), in differente reactions. Results. The T. cruzi strains isolated from the blood cultures of the mother and her son showed the same amplification profile by the two AP-PCR tests; this corresponded with profiles of the T. cruzi I strains used as controls. However, T. cruzi II was also found in the blood culture from the newborn. Conclusions. This is the first case of Chagas disease transmission reported in Moniquirá, demonstrating that this form of transmission occurs in Colombia. The presence of both groups of T. cruzi in the newborn sample suggests mixed infection in the mother as well, with a higher prevalence of T. cruzi I, at least in the mother's blood culture.

Caracterización molecular de los genes histona H2A y ARNsno-Cl de Trypanosoma rangeli: aplicación en pruebas diagnósticas / Molecular characterization of histone H2A and snoRNA-Cl genes of Trypanosoma rangeli: application in diagnostic tests

La aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar e identificar Trypanosoma rangeli y Trypanosoma rangeli presenta a menudo dificultades de interpretación. Así, algunas pruebas generan la amplificación de bandas similares provenientes de uno de los dos parásitos, fragmentos polimórficos de un mismo parásito, o la prevalencia en la detección de T. cruzi en infecciones mixtas. En este estudio se presentan y analizan los trabajos de investigación básica realizados con el objeto de diseñar y estandarizar pruebas de PCR específicas de cada parásito. Los iniciadores TcH2AF/R se diseñaron sobre la base de la región diferencial observada entre las unidades génicas que contienen los genes h2a en estos tripanosomas. Esta pareja de iniciadores amplifican un fragmento de 234 pb específico para T. cruzi (cepas I y II). Los iniciadores TrF/R2 anillan en las regiones intergénicas del fragmento génico de 801 pb codificante para seis transcritos que forman la agrupación ARNsno-Cl en T. rangeli. Estos iniciadores amplifican un fragmento de 620 pb exclusivo de las cepas KP1(-) y KP1(+) de este parásito. La aplicación de estas PCR en vectores infectados y en pacientes con enfermedad de Chagas muestra que ambas pruebas constituyen herramientas útiles para el diagnóstico y la identificación diferencial de estos tripanosomátidos.

The application of polymerase chain reaction (PCR) to detect Trypanosoma rangeli and Trypanosoma rangeli often presents interpretation challenges. For example, some tests yield the amplification of similar bands from either parasite, polymorphic fragments of the same parasite, or present deviation towards T. cruzi in mixed infections. In this study, the basic researching needed for designing and standardizating specific PCR tests for each parasite species PCR are shown and analyzed. The TcH2AF/R primers were designed on the basis of the differential gene region observed between the histone h2a genic units of these parasites. These primers amplify a specific 234 bp fragment in T. cruzi (T. cruzi I and II strains). The TrF/R2 primers anneal to the intergenic regions of an 801 bp gene fragment encoding for six transcripts that conform the snoRNA-Cl cluster in T. rangeli. These primers amplify a fragment of 620 bp exclusively in KP1(-) and KP1(+) strains of the parasite. The application of these PCR tests in infected vectors and in chagasic patients show that both tests constitute useful tools for the diagnosis and differential identification of these Trypanosomatids. Key words: histone, RNA small nucleolar (snoRNA), polymerase chain reaction (PCR), Trypanosoma.

Evaluación de las pruebas de PCR TcH2AF-R y S35-S36 para la detección de Trypanosoma cruzi en tejido cardiaco de ratón / Evaluation of TcH2AF-R and S35-S36 primers in PCR tests for the detection of Trypanosoma cruzi in mouse cardiac tissue

Introducción. El trasplante es una opción terapéutica en la cardiomiopatía chagásica. Para la detección temprana de una posible reactivación de la infección, se propone el uso de pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de biopsias endomiocárdicas; el modelo de ratón es una aproximación preliminar para evaluar la aplicación de éstas. Objetivo. Evaluar la aplicación de las pruebas de PCR basadas en los iniciadores TcH2AF-R y S35-S36 para la detección de T. cruzi en tejido cardiaco de ratones infectados con el parásito. Materiales y métodos. Se infectaron por vía intraperitoneal dos grupos de ratones ICR de 15 y 10 individuos con 0,3 ml de PBS que contenían 1x106 tripomastigotes de la cepa MHOM/CO/2001/D.A. (T. cruzi I) o 1x104 tripomastigotes de la cepa MHOM/BR/00/Y (T. cruzi II), respectivamente. El seguimiento de la parasitemia se realizó mediante microhematocrito y presencia de parásitos en el corazón a los 30, 60 (modelo agudo), 100 y 150 (modelo crónico) días por medio de histopatología y de las PCR TcH2AF-R y S35-S36. Resultados. La histopatología mostró alteraciones en el miocardio y presencia de amastigotes en los modelos agudo y crónico. En contraste al microhematocrito y al análisis histopatológico, la PCR S35-S36 permitió la detección de ambas cepas del parásito. La PCR TcH2AF-R detectó la cepa T. cruzi I con un desempeño superior al microhematocrito y al análisis histopatológico. Conclusiones. El uso de ambas pruebas de PCR puede ser útil en la confirmación de la reactivación de la infección postrasplante.

Detection of Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli infection in triatomine vectors by amplification of the histone H2A/SIRE and the sno-RNA-C11 genes

Trypanosoma rangeli is non pathogenic for humans but of important medical and epidemiological interest because it shares vertebrate hosts, insect vectors, reservoirs and geographic areas with T. cruzi, the etiological agent of Chagas disease. Therefore, in this work, we set up two PCR reactions, TcH2AF/R and TrFR2, to distinguish T. cruzi from T. rangeli in mixed infections of vectors based on amplification of the histone H2A/SIRE and the small nucleolar RNA Cl1 genes, respectively. Both PCRs were able to appropriately detect all T. cruzi or T. rangeli experimentally infected-triatomines, as well as the S35/S36 PCR which amplifies the variable region of minicircle kDNA of T. cruzi. In mixed infections, whereas T. cruzi DNA was amplified in 100 percent of samples with TcH2AF/R and S35/S36 PCRs, T. rangeli was detected in 71 percent with TrF/R2 and in 6 percent with S35/S36. In a group of Rhodnius colombiensis collected from Coyaima (Colombia), T. cruzi was identified in 100 percent with both PCRs and T. rangeli in 14 percent with TrF/R2 and 10 percent with S35/S36 PCR. These results show that TcH2AF/R and TrF/R2 PCRs which are capable of recognizing all T. cruzi and T. rangeli strains and lineages could be useful for diagnosis as well as for epidemiological field studies of T. cruzi and T. rangeli vector infections.

Embora o Trypanosoma rangeli não seja patogênico para o homem, sua importância médica e epidemiológica reside no fato de compartilhar vetores, reservatórios e áreas geográficas com o Trypanosoma cruzi, agente causal da Doença de Chagas. Neste estudo, para distinguir T. cruzi de T. rangeli em vetores com infecções mistas, se utilizaram duas amplificações de PCR; TcH2AF/R para o gen da histona H2A/SIRE e TrFR2, para um gen repetitivo de ARN nucleolar Cl1 (sno-RNA-Cl1). Assim como a PCR S35/S36, ambas as reações foram capazes de detectar corretamente a presença de T. cruzi ou T. rangeli em triatomíneos infectados experimentalmente. Nas infecções mistas, o ADN de T. cruzi foi amplificado em 100 por cento das amostras quando se utilizaram TcH2AF/R e S35/S36, enquanto T. rangeli foi detectado em 71 por cento delas com os iniciadores TrF/R2 e em 6 por cento, com S35/S36. Adicionalmente, em um grupo de Rhodnius colombiensis coletados na região de Coyaima (Tolima), T. cruzi foi identificado em 100 por cento com ambas PCRs e T. rangeli em 14 por cento delas com os iniciadores TrF/R2 e em 10 por cento, com S35/S36. Estes resultados mostram que as reações de PCR TcH2AF/R e TrF/R2, capazes de reconhecer todas as cepas e linhagens de T. cruzi e T. rangeli, podem ser úteis no diagnóstico e também nos estudos epidemiológicos do campo com vetores infectados pelo T. cruzi e T. rangeli.

Comparación de una prueba de PCR basada en los genes codificantes para la histona H2A/SIRE con pruebas serológicas convencionales para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas crónica en pacientes colombianos / Comparison of a PCR test based on the histone H2A/SIRE genes with classical serological tests for the diagnosis of chronic Chagas disease in Colombian patients

Introducción. El diagnóstico de la enfermedad de Chagas en sus fases latente y crónica se dificulta por la baja parasitemia, razón por la cual se recurre a métodos serológicos y moleculares. Objetivo. Comparar la prueba de reacción en cadena de la polimerasa basada en la amplificación del elemento SIRE insertado en el gen que codifica para la histona H2A con las pruebas serológicas convencionales para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas en pacientes colombianos. Materiales y métodos. Se realizó un estudio de concordancia comparando la PCR TcH2AF/R con las pruebas de inmunoensayo enzimático e inmunofluorescencia indirecta, determinándose además la sensibilidad y especificidad de la prueba. Se clasificaron y examinaron 156 individuos según los hallazgos clínicos y epidemiológicos y los resultados de las pruebas serológicas. Adicionalmente, 97 de las 156 muestras fueron comparadas con la PCR S35/S36. Resultados. De 156 muestras, 89 (57 por ciento) fueron positivas por IFI y ELISA, y 84 (53,8 por ciento) presentaron el perfil de amplificación correspondiente a la banda esperada de 234 pb, obteniéndose una sensibilidad de 88 por ciento (I.C. 95 por ciento: 75 por ciento - 95 por ciento) y especificidad de 92,5 por ciento (I.C. 95 por ciento: 87,7 por ciento - 97,2 por ciento). El índice kappa, indicador de concordancia entre las pruebas serológicas y TcH2AF/R fue de 0,8 (I.C. 95 por ciento: 73 por ciento - 86 por ciento), en tanto entre las PCR TcH2AF/R y S35/S36 fue de 0,9 (I.C. 95 por ciento: 84 por ciento - 96 por ciento), interpretados como una concordancia buena y casi perfecta, respectivamente. Conclusiones. La PCR TcH2AF/R es una prueba diagnóstica promisoria complementaria a las pruebas serológicas, para la detección de Trypanosoma cruzi.

Introduction. Diagnosis of Chagas disease in its latent and chronic phase is difficult because of the low parasitemia levels. Therefore, serological and molecular techniques are necessary to achieve an appropriate diagnosis. Objective. The polymerase chain reaction based on the amplification of the SIRE element inserted into H2A encoding genes was compared with classical serological tests for the diagnosis of Chagas disease in Colombian patients. Materials and methods. An agreement study was carried out by comparing the PCR with ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) and IFAT (indirect immunofluorescence) tests. In addition, the PCR sensitivity and specificity were determined. A sample of 156 individuals was tested with the H2A PCR primers after a Chagas disease classification based on clinical, epidemiological and serological data associated with each patient. In addition, 97 out of 156 samples were also compared with the S35/S36 PCR primers. Results. Eighty-nine of 156 samples (57%) were positive by both IFAT and ELISA and 84 (53.8%) presented the expected 234 bp amplification fragment. The sensitivity of the TcH2AF/ R PCR was 88% (95% C.I.: 75%--95%) and its specificity 92.5% (95% C.I.: 87.7%--97.2%). The kappa index for concordance between serological tests and TcH2AF/R PCR was 0.8 (95% C.I.: 73%--86%), and between the TcH2AF/R and S35/S36 PCR primers was 0.9 (95% C.I.: 84%-- 96%). These indices indicated a “good” and “almost perfect” agreement, respectively. Conclusions. The TcH2AF/R PCR is a promising diagnostic tool for the detection of T. cruzi and is suggested as a tool complementary to the classical serological tests.

Diferenciación de especies de Rhodococcus mediante una prueba de PCR-RFLP basada en los genes codificantes para la subunidad 16S ribosomal / Differentiation of Rhodococcus's species by means of a test of PCR-RFLP based on the genes codificantes for the subunit 16S ribosomal

Dada la dificultad en diferenciar las especies de Rhodococcus por pruebas bioquímicas, se desarrolló unaprueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), seguida de un ensayo de Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción (PCR-RFLP) para la diferenciación de las mismas. R. equi, R. rhodnii y otrasbacterias fueron cultivadas en agar sangre y BHI a 37 y 26 °C. El ADN bacteriano fue extraído y amplificadocon los iniciadores descritos por Hypsa y Dale. Los productos de amplificación fueron sometidos a digestióncon diversas enzimas de restricción y los patrones de restricción obtenidos fueron confirmados mediante análisis in silico. Se obtuvo el fragmento de amplificación esperado de 1300 pb en todas las bacterias analizadas. Se pudo diferenciar R. equi de R. rhodnii con las endonucleasas PstI y HindIII y con respecto a otrasbacterias con PstI, HindIII, SstI, BamHI y EcoRI. Los patrones de restricción obtenidos fueron confirmadosmediante análisis in silico. La prueba PCR-RFLP constituye una alternativa para la diferenciación entreespecies de Rhodococcus tales como R. equi y R. rhodnii.

Diseño y estandarización de una prueba de PCR para la detección específica de Trypanosoma cruzi / PCR design and standardization for Trypanosoma cruzi specific detection

Objetivo: Tripanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, presenta dos tipos de unidades H2A:1,2 y 0,76 Kb. Dada la ausencia de la unidad de 1,2 KB en T. rangeli, en este trabajo se desarrolló una prueba de PCR para la detección de T. cruzi, usando como blanco este gen. Materiales y métodos: los oligonucleótidos TcH2AF y TcH2AR fueron diseñados usando el programa Oligo TM versión 4.0 for Macintosh. La reacción de PCR (Tris-HCI 10 mM pH 9, KCl 50 mM, triton x-100 0,1 por ciento dNTPs 200 mM, cebadores 20 pmoles, MgCl2 1,5 mM, Taq DNA polimerasa 1,25 U y ADN 125 ng) fue sometida al siguiente programa en un termociclador PTC-100 MJ-Research: denaturación 95°C por 5 min, 15 ciclos con denaturación a 95°C por 30 s, anillaje y extensión a 72°C por 1 min y 20 ciclos con anillaje a 65°C durante 30 s y extensión a 72°C por 30 s. los productos amplificados fueron visualizados en geles de agarosa al 1,5 por ciento, teñidos con bromuro de etidio. Resultados: TcH2AF/R amplifican una banda de 230 pb en cepas pertenecientes a los Zimodemas I, II y III de T.cruzi, con una sensibilidad de 1fg aun en la presencia de ADN heterólogo; mientras que no amplifican el ADN de cepas de T. rangeli tanto KP1(+) como KP(-). Conclusiones: esta PCR constituye una herramienta potencial para la detección de T. cruzi en muestras biológicas de vector, humano y/o ratón